Մասնագետների համար

Ներածություն։ Մոլեկուլային գենետիկայի զարգացման հետ մեկտեղ պարզ դարձավ, որ բջիջների չարորակ տրանսֆորմացիայի և կանցերոգենեզի հիմքում ընկած է բջիջների գենոտիպում առաջացած փոփոխությունները։ ՈՒռուցքի յուրաքանչյուր տիպին բնորոշ է անհատական գենետիկական փոփոխություններ, ինչով էլ պայմանավորվում է ուռուցքի կենսաբանական ագրեսիվությունը, ինվազիվ աճի և մետաստազներ առաջացնելու հատկությունները։ ՈՒռուցքների գենետիկական ապարատում առաջացած փոփոխությունների շարքին են պատկանում քրոմոսոմների քանակական և կառուցվածքային խանգարումները, գենային մուտացիաները և գեների ամպլիֆիկացիան։ Ժամանակակից ցիտոգենետիկ մեթոդների կիրառումը օնկոմորֆոլոգիայում  հնարավորություն են տալիս ուսումնասիրել և հայտնաբերել այս շեղումները, ինչի շնորհիվ հնարավոր է դառնում կատարել ուռուցքների վաղ ախտորոշում, հիվանդության ընթացքի կանխորոշում և բուժման նորագույն մեթոդների մշակում [1]։ ՈՒռուցքային բջիջներում հայտնաբերված գենային շեղումներից է HER2 գենի ամպլիֆիկացիան։ ՈՒռուցքներում HER2 գենի ամպլիֆիկացիան ուղեկցվում է համանուն ռեցեպտորի հիպերէքսպրեսիայով և բերում է բջիջների պրոլիֆերացիայի ակտիվացման, ընկճում է ապոպտոզը, թուլացնում է միջբջջային կապերը, ինչը նպաստում է ուռուցքների ինվազիվ աճի և մետաստազներ տալու ունակության բարձրացմանը։ HER2 գենը  տեղակայված է 17-րդ քրոմոսոմում և կոդավորում է HER2 ռոցեպտորի սինթեզը։ HER2 ռեցեպտորը իրենից ներկայացնում է տրանսմեմբրանային գլիկոպրոտեին, որը ունի 185ԿԴ մոլեկուլային զանգված և օժտված է թիրոզին կինազային ակտիվությամբ։ HER2-ը ռեցեպտոր է հանդիսանում աճի էպիդերմալ գործոնի համար։ HER2 ռեցեպտորի ֆիզիոլոգիական ֆունկցիան է` բջջի աճի, տարբերակման և պրոլիֆերացիայի կարգավորումը։ Նորմալ բջջում նկատվում է HER2 ռեցեպտորի աննշան էքսպրեսիա, սակայն բջիջների չարորակ տրանսֆորմացիայի ժամանակ առաջանում է այս ռեցեպտորի արտահայտված հիպերէքսպրեսիա [3,5]։ Ձվարանի քաղցկեղներում HER2 ռեցեպտորի հիպերէքսպրեսիան հանդիպում է 20-30%-ում, կրծքագեղձի քաղցկեղում HER2 գենի ամպլիֆիկացիան և ռեցեպտորի հիպերէքսպրեսիան հանդիպում է 15-30%-ում, էնդոմետրիալ քաղցկեղներում HER2 գենի ամպլիֆիկացիան հանդիպում է 21-47% դեպքերում [11]։ Աշխատանքները ուղղված տարբեր ուռուցքներում HER2 գենի դերի բացահայտմանը դեռևս շարունակվում են։

ՈՒսումնասիրության նպատակը։ Այս ուսումնասիրության նպատակն է ժամանակակից գրականության վաերլուծության միջոցով պարզել HER2 գենի կարգավիճակի որոշման մեթոդները, դրանց միջև կատարել համեմատական վերլուծություն, գնահատել դրանց արդյունավետությունը և կլինիկայում լայն կիրառության հնարավորությունները։

Գրականության վերլուծություն։ ՈՒռուցքներում առաջացող գենային փոփոխությունները հայտնաբերելու նպատակով ժամանակակից բժշկության մեջ կիրառվում են մի քանի եղանակներ, որոնցից առավել լայն կլինիկական նշանակություն են ստացել իմունոհիստոքիմիական մեթոդը, ֆլյուորեսցենտային in situ հիբրիդացման (FISH) և քրոմոգենային in situ հիբրիդացման  (CISH) մեթոդները։ Իմունոհիստոքիմիական մեթոդը հնարավորություն չի տալիս ուղղակիորեն հայտնաբերել գենային փոփոխությունները։ Այս հետազոտոթյան ժամանակ օգտագործվում է հակամարմիններ, որոնց միջոցով որոշվում է բջջում սպիտակուցների քանակական փոփոխությունները և դրա հիման վրա

կատարվում է եզրակացություն գենոտիպում առաջացած փոփոխությունների մասին։ Մասնավորապես բջջում HER2 ռեցեպտորի հիպերէքսպրեսիան թույլ է տալիս ենթադրել HER2 գենի

ամպլիֆիկացիայի մասին։ Հասկանալի է դառնում, որ բջջում գենային փոփոխությունները հայտնաբերելու նպատակով կիրառվող իմունոհիստոքիմիական մեթոդը  չի կարող ունենալ բավական ճշգրտություն, քանի որ բջջում ռեցեպտորների հիպերէքսպրեսիա կարող է դիտվել նաև առանց գենի ամպլիֆիկացիայի [2,7]։ Իմունոհիստոքիմիական մեթոդով HER2 ռեցեպտորի

հիպերէքսպրեսիան որոշելու համար օգտագործում են մոնոկլոնոլ հակամարմիններ  HER2 ռեցեպտորի արտաբջջային դոմենի հանդեպ (HercepTest, Dako)։ Հետազոտության արդյունքները գնահատվում է երեք բալանի համակարգով` 0-ից մինջև 3+։ 0 և 1+ սանդղակները գնահատվում են, որպես բացասական արդյունք, այսինքն HER2 ռեցեպտորի հիպերէքսպռեսիան բացակայում է (նկ.1-ի Ա, նկարները վերցրած են HER2 մեթոդական ձեռնարկից [3])։ 30%-ից ավել բջիջների բջջաթաղանթների ինտենսիվ ներկվելու դեպքում արդյունքը գնահատվում է 3+ բալ, ինչը նշանակում է HER2 ռեցեպտորի դրական հիպերէքսպրեսիա (նկ.1-ի Գ)։ 30%-ից ավել բջիջների բջջաթաղանթների չափավոր ներկվելու դեպքում արդյունքը գնահատվում է 2+ (նկ.1-ի Բ)։ Այս դեպքում HER2 ռեցեպտորի և առավել ևս HER2 գենի կարգավիճակի վերաբերյալ ճիշտ դատողություններ կատարել հնարավոր չէ, և հստակ ախտորոշման համար անհրաժեշտ է կատարել հետազոտություն FISH կամ CISH մեթոդով [3,10]։

FISH մեթոդով HER2  գենի (տեղակայումը 17q21) ամպլիֆիկացիան հայտնաբերելու նպատակով միաժամանակ կիրառվում է 2 տիպի ԴՆԹ-զոնդեր` քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ-զոնդ 17-րդ քրոմոսոմը հայտնաբերելու նպատակով (կանաչ ազդանշան) և գեն յուրահատուկ ԴՆԹ-զոնդ՝ HER2 գենը հայտնաբերելու համար (կարմիր ազդանշան), արդյունքները գնահատվում են լյումինեսցենտային մանրադիտակով [4]։

նկ. 2 - HER2 գենի ամպլիֆիկացիա չկա x1000

նկ. 3 - HER2 գենի ուժեղ ամպլիֆիկացիա x1000

Նորմալ բջջում այս ազդանշանները հանդիպում են երկուական օրինակով (նկ.2, նկարը վերցրված է /Архив патология/ պարբերականից [4])։ HER2 գենի ամպլիֆիկացիան համարվում է դրական, երբ կարմիր ազդանշանը գերազանցում է կանաչին 2 և ավելի անգամ (նկ.3, նկարը վերցրված է /Современная онкология/ պարբերականից [2])։  CISHմեթոդով HER2 գենի ամպլիֆիկացիան հայտնաբերելու նպատակով կիրառվում է մեկ գեն յուրահատուկ ԴՆԹ-զոնդ, կոմպլեմենտար է HER2 գենին։ Վերջինս լուսային մանրադիտակով երևում է շագանակագույն գունակների տեսքով։ Եթե առնվազն 50% բջիջներում հանդիպում է 1-ից 2 քրոմոգենային ազդանշան, ապա HER2  գենի ամպլիֆիկացիան համարվում է բացասական (նկ.4-ի Ա, նկարը վերցրված է /Modern Pathology/ պարբերականից [12])։ HER2 գենի ամպլիֆիկացիան համարվում է դրական, երբ առնվազն 50% բջիջջներում քրոմոգենային ազդանշանների քանակը 6-ից ավել է կամ, եթե բջջում կան խոշոր գունային կլաստերներ (նկ.4-ի Գ)։ Այն դեպքում երբ բջիջների 50%-ում ազդանշանների քանակը 3-ից 5 հատ է (նկ.4-ի Բ) համարվում է, որ կա HER2 գենի թույլ ամպլիֆիկացիա, սակայն այս արդյունքը հավաստի չէ, քանի որ այդպիսի արդյունքը կարող է պայմանավորված լինել ոչ միայն HER2  գենի ամպլիֆիկացիայով այլ նաև 17-րդ քրոմոսոմի պոլիպլոիդիայով [4,6]։ HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի ճշգրիտ որոշումը շատ կարևոր է, քանի որ դա ոչ միայն հնարավորություն է տալիս կատարել կանխատեսումներ հիվանդության ընթացքի վերաբերյալ, այլ նաև հնարավորություն է ստեղծում արդյունավետ կատարել քիմիոթերապեվտիկ դեղամիջոցի ընտրությունը։ Կրծքագեղձի ինվազիվ քաղցկեղով այն հիվանդներին, որոնց մոտ հաստատվում է HER2 գենի ամպլիֆիկացիան ցուցված է հերցեպտին (տրաստուզումաբ) դեղամիջոցի նշանակումը։ Հերցեպտինը՝ հանդիսանալով մոնոկլոնալ հակամարմին HER2 ռեցեպտորի հանդեպ, անարդյունավետ է ազդում այն հիվանդների վրա, որոնց մոտ բացակայում է այդ ռեցեպտորի հիպերէքսպրեսիան [9]։

Դասական CISH հետազոտության ժամանակ, երբ HER2 գենի օրինակները բջջում լինում է 5-10 հատ (թույլ ամպլիֆիկացիա) խնդիր է առաջանում տարբերակել դա HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի հետևանք է, թե պատճառը 17-րդ քրոմոսոմի պոլիպլոիդիան է։ Որովհետև 17-րդ քրոմոսոմի պոլիպլոիդիայի ժամանակ HER2 գենի օրինակների թիվը նույնպես շատանում է։ Տարբերակիչ ախտորոշում կատարելու նպատակով կատարվում է FISH հետազոտություն կամ երկգույն CISH հետազոտություն, որի դեպքում օգտագործվում է երկու ԴՆԹ զոնդ` դրոշմված տարբեր քրոմոգեններով։ Օգտագործվում է քրոմոսոմ յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ` 17-րդ քրոմոսոմը հայտնաբերելու համար (կանաչ ազդանշան) և գեն յուրահատուկ ԴՆԹ զոնդ HER2  գենը հայտնաբերելու համար (կարմիր ազդանշան)։ Արդյունքները գնահատվում է լուսային մանրադիտակով։ Նորմալ դիպլոիդ բջջում երկու տեսակի ԴՆԹ զոնդերն էլ հանդիպում են երկուական օրինակներով (նկ. 5-ի Ա)։ HER2 գենի ամպլիֆիկացիայի ժամանակ 17-րդ քրոմոսոմը հանդիպում է երկու օրինակով (կանաչ ազդանշան), իսկ HER2 գենը հանդիպում է բազմաթիվ օրինակներով կամ խոշոր կլաստերներով (կարմիր ազդանշան) (նկ.5-ի Բ) [8]։ 

նկ. 5 - Երկգույն CISH մեթոդ x400
Ա - HER2 գենի ամպլիֆիկացիա չկա
Բ - HER2 գենի դրական ամպլիֆիկացիա
Նկարը վերցված է /իմունոհիտոքիմիական մեթոդներ/ ձեռնարկից [8]:

Եզրակացություն։ Իմունոհիստոքիմիական մեթոդով հնարավոր է լինում որոշել HER2 սպիտակուցի հիպերէքսպրեսիան, սակայն դա ախտորոշման օբեկտիվ մեթոդ չի կարող համարվել HER2 գենի ամպլիֆիկացիան գնահատելու համար, քանի որ իմունոհիստոքիմիական մեթոդով որոշվում է բջջում HER2 ռեցեպտորի քանակական փոփոխությունները և չի պարզաբանվում թե ինչ է տեղի ունենում բջջում գենային մակարդակով։

CISH մեթոդի առավելությունը FISH մեթոդի համեմատ կայանում է նրանում, որ հետազոտության այս տեսակի ժամանակ պահպանվում է հյուսվածքի մորֆոլոգիական պատկերը` հնարավորություն տալով նույն պրեպարատի վրա գնահատել և մորֆոլոգիական, և գենետիկ առանձնահատկությունները։ Մյուս կողմից հիբրիդացման արդյունքները գնահատվում են ոչ թե լյումինեսցենտային այլ լուսային մանրադիտակի միջոցով, ինչի շնորհիվ այս մեթոդը դառնում է ավելի մատչելի և պրակտիկ կիրառման համար։ CISH մեթոդով  ստացված պրեպարատները կարելի է երկար ժամանակ պահպանել արխիվում, մինչդեռ FISH հետազոտության ժամանակ դա հնարավոր չէ, քանի որ ֆլյուորեսցենտային ազդանշանները արագ անհետանում են։

Գրականության ցանկ

1. Горбунова В.Н., Имянитов Е.Н.; Кафедра медицинской генетики СПбГПМА;  Генетика и Канцерогенез; 2007г.
2. 2.    Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Ряазанцева А.А., Батева М.В., Франк Г.А.;  Сравнительное исследование определения HER2-статуса рака молочной железы методами иммуногистохимии и in situ гибридизации.; Современная онкология; 2009г., том 11, ст.6-9.
3. Завалишина Л.Э., Андреева Ю.Ю., Рязанцев А.А.,Франк Г.А.,; Методические рекомендации по проведению HER2-тестирования рака молочной желези; Архив патологии; 2011г.
4. Завалишина Л.Э., Ряазанцева А.А., Батева М.Б., Андреева Ю.Ю., Франк Г.А.;  Сравнительное исследование определение HER-2-статуса при раке молочной железы методами флюресцентной (FISH) и хромогенной (CISH)  in situ  гибридизации; Архив патология   април 2008  N3 ст.9-11.
5. Antonio C. W., Elizabeth M.,  Hammond H., et al.; Стандартные рекомендации Американцкого общества клинической онкологии и Коллегии американских патологов  по определению рецептора эпидермалного фактора роста человека 2-го типа (HER2) при раке молочной железы; Archives of Pathology&Laboratory medicine, Translated form; 2007, vol.13(1) pp18-50.
6. Arnould L., Denoux Y., MacGrogan G., Penault-Llorca F., et al.; Agreement between chromogenic in situ hybridisation (CISH) and FISH in the determination of HER2 status in breast cancer; British Journal of Cancer, 2003 (88), pp.1587 – 1591.
7. Bhargava R.,  Priti L., Beiyun C.; HER-2/neu and Topoisomerase IIα Gene Amplification and Protein Expression in Invasive Breast Carcinomas Chromogenic In Situ Hybridization and Immunohistochemical Analyses; Am. J. Clinical Pathology; 2005; 123, pp.889-895
8. George L. Kumar, Lars R.; Иммуногистохимические методы։ Руководство; Глава 14, Двухцветный CISH и конвертирование FISH в CISH; 2011г.; ст.142-147.
9. Jeffrey S.R., Slodkowska E. A., Fraser W. S., Puszta L, Peter M. Ravdin, Gabriel N. Hortobagy; The HER-2 Receptor and Breast Cancer։ Ten Years of Targeted Anti–HER-2 Therapy and Personalized Medicine. The Oncologist 2009; 14։ pp.320–368.
10. Manuelito A. M., Raymundo W. L.; Chromogenic in situ hybridization (CISH)։ a novel alternative in screening archival breast cancer tissue samples for HER-2/neu status; Breast Cancer Research Vol. 6, No 5, 2004, p. 593-600.
11. Nida I., Naveed I.; Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2) in Cancers։ Overexpression and Therapeutic Implications; Molecular Biology International; 2014; pp.1-9.
12. Zhao J., Wu R., Au A., Marquez A., Yu Y., Shi Z.; Determination of HER2 Gene Amplification by Chromogenic In Situ Hybridization (CISH) in Archival Breast Carcinoma; Modern Pathology; 2002 Jun, 15(6), pp.657-665.

Վ.Ռ.Դաբաղյան
ԵՊԲՀ, ախտաբանական անատոմիայի և կլինիկական մորֆոլոգիայի ամբիոն